分子生物学

提供分子生物学相关技术服务：核酸提取、载体构建、蛋白表达与纯化、CRISPR/Cas9介导的基因敲除细胞系和动物、实时荧光定量PCR等服务

CRISPR/Cas9介导的基因敲除细胞系筛选和建立

康朗生物可以通过自身T细胞和B细胞介导的免疫系统抵抗外源微生物的入侵和增殖，而低等的原核生物也有自己的应对策略完成自我保护。CRISPR/Cas9系统就是其中一项重要的武器，是细菌为应对病毒和质粒攻击而演化来的一种获得性免疫防御机制。CRISPR/Cas9系统中crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链RNA。此tracrRNA/crRNA复合体作为引导员引导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点切断双链DNA。进一步通过细胞内同源重组等修复机制在切割位点缺失或插入不定长度的碱基序列，使得后续的细胞产生移码突变，最终导致蛋白质活性的丧失。

在针对细胞的基因组编辑过程中，我们通常将tracrRNA和crRNA融合成为1条sgRNA克隆至表达载体上，同样可以起到靶向剪切的作用。通过对Cas9核酸酶进行改造，使其可对任何物种的基因组进行高效定向的编辑，可有效避免脱靶效应。

服务内容

1. 敲除基因序列分析，并设计针对该序列的3-5条sgRNA

2. 将sgRNA与表达载体连接，筛选阳性sgRNA克隆；

3. sgRNA转染细胞，流式分选GFP阳性细胞，筛选高效sgRNA；

4. 将sgRNA和Cas9质粒共转染细胞，并筛选鉴定基因敲除细胞系敲除细胞株；

5. 基因敲除细胞株扩大培养，并通过荧光定量PCR和Western Blotting检测基因敲除情况；

6. 细胞株传代培养，并进行PCR二次鉴定。

实验收费标准和周期

说明：关于基因敲除细胞系的筛选原则上进行一次转染和流式筛选，公司确保筛选到单等位基因敲除细胞系。若未获得双等位基因敲除细胞系则再进行一次转染和筛选。如果仍未获得等位基因敲除细胞系则终止实验，公司提供单等位基因敲除细胞系。

客户须知

1. 请提供待敲除的细胞系和培养条件；

2. 请提供待敲除基因信息（基因名称，物种，NCBI号等）；

3. 如有特殊要求（特定位点敲除等）请提前说明；

公司交付产物

1. 基因敲除细胞系两管，每管细胞数目>1*106；

2. 敲除细胞系基因型鉴定结果；

3. 敲除细胞系荧光定量PCR和WB鉴定结果；

4. 实验报告。

基因扩增，载体构建和蛋白表达纯化

实验原理

利用基因工程的基本原理和方法，将DNA或cDNA片段与载体连接，获得能够表达目的基因的载体。我们可以在目的基因上添加小分子量标签（FLAG，HA，myc等）方便后续表达检测。也能够加入荧光标签（GFP, RFP, CFP,BFP, YFP等）直观的观察蛋白表达情况。我们独特的多顺反子表达载体，可以同时表达多个蛋白，为研究蛋白相互作用或者多亚基蛋白共表达提供了极大的便利。根据客户的需要，我们还可以对载体进行改造，满足不同的实验目的和要求。在进行基因功能学实验时，通常要对基因的某些位点进行突变。我们通常使用高保真Pfu酶，利用重叠延伸PCR或者定点突变试剂盒的方法在目的基因中引入单个或多个碱基的突变，包括碱基的添加，删除，替换等，从而对改变的目的蛋白进行性状和表型的研究。对于未知基因的序列，Rapid-amplification of cDNA ends（RACE）方法可以满足大家的要求。这是一种基于一段已知的cDNA片段，通过向两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法。本公司有多年RACE扩增经验和优化后的实验技术，能够有效扩增大片段的未知序列。

服务内容

1．通过对序列进行分析，设计特异性引物扩增目的片段；

2．通过酶切连接或In-Fusion等方法，将目的片段克隆至表达载体上；

3．原核表达蛋白可通过IPTG等进行诱导表达，SDS-PAGE电泳检测，Western Blotting检测；

4．将真核表达载体转染293T细胞，直接荧光观察或Western Blotting检测，验证蛋白表达；

5．原核表达蛋白的大量表达和纯化；

6．真核表达蛋白体内和体外功能研究（详见细胞功能学实验部分）；

7. 基因编码区，非编码区的单位点，大片段基因，高GC含量和重复序列基因的单位点和多位点突变；

8. 未知基因3’和5’RACE特异性引物的设计和3’和5’端片段的扩增；

载体构建基本流程

载体构建收费标准

注：基因组DNA或cDNA＞1ug；质粒＞100 ng；PCR产物＞100ug；

蛋白表达纯化基本流程

蛋白表达和纯化收费标准

基因定点突变基本流程

公司交付

1.含质粒的甘油菌和质粒（>5微克）

2. 测序结果和碱基序列图

3 表达纯化的蛋白和电泳图

4. Western blotting检测结果

5. 实验报告

荧光定量PCR

实验原理

在进行基因功能研究时，我们通常会通过观察靶基因的表达量变化来判断目的基因或药物等对细胞的影响。靶基因的表达量变化可以通过在mRNA和蛋白水平进行检测。蛋白水平通常使用Western Blotting方法进行（详见WB检测服务目录），而在mRNA水平有多种方法进行检测，比如反转录PCR，Northern Blotting和荧光定量PCR（RT-qPCR）等。荧光定量PCR方法由于其可以准确快速的对多个基因进行精确定量而得到广泛的应用。该方法是一种基于普通PCR的改进方法，在PCR扩增的过程中利用具有DNA亲和性的荧光染料或荧光标记的核苷酸探针，每个循环收集一次荧光强度信号。通过荧光强度的强弱反应扩增片段的丰度。随着PCR 反应中目的片段含量的增加，荧光信号强度也等比例增强。从而实现对起始模板定量及定性的分析。这种方法比普通的反转录PCR能更加直观的反应产物含量的多少给出定量的结果，与Northern Blotting相比更加简洁直观，目前是在对基因mRNA水平检测最为常用的一种方法。

服务内容

一、核酸提取

使用试剂盒或者Trizol法对哺乳动物细胞和组织，植物，酵母，真菌，细菌和土壤等样品中的RNA和DNA进行提取。并对提取的样品进行浓度和纯度的检测，作为后续检测用模板。

二、RNA的反转录

与可以进行直接检测的DNA样品不同，RNA样品需要进行反转录为cDNA来进行进一步检测。我们首先使用进口的DNase对RNA样品进行处理，消除基因组DNA对后续检测的干扰，再使用进口反转录试剂盒或者反转录酶对RNA样品进行高效的反转录，使得微量表达的样品也能进行很好的扩增。

三、荧光定量PCR检测基因表达量

根据检测目的的不同，荧光定量PCR可以分为相对荧光定量PCR和绝对荧光定量PCR两种。每种定量方法中根据检测标志物的不同分为染料法和探针法。较为常用的染料是SYBR Green，其能够与DNA高度特异性的结合，具有很高的灵敏度。对于低表达量的样品或特殊样品，我们建议使用探针法进行检测。根据目的序列设计一条寡核苷酸探针，再标记上荧光基团，能够极大的增加检测灵敏度和特异性。可以检测低至个位数的目的基因样品。

四、特殊方法对待特殊样品

我们拥有十年以上的核酸提取经验，对于特殊样品，如土壤，我们优化了传统的Trizol方法，能够高效的提取高纯度的核酸样品，可满足后续荧光定量和高通量测序的需求。对于核酸含量很少的样品，如拭子，环境水样等。我们使用特殊的富集方法将样品浓缩以减少样品损失，再利用公司独特的提取方法最大限度的提取样品中的核酸，能够满足后续的检测需求。此外，对于其它无可参考方法的样品，我们可以根据经验创造属于它的个性提取方法。

五、我们免费提供

（1）引物和探针的设计，以及引物的合成；

（2）绝对定量和相对定量选择的咨询和建议；

（3）探针法和染料法选择的咨询和建议；

（4）核酸定量；

（5）内参基因的检测；

（6）数据统计和分析；

（7）其它我们荧光定量PCR相关的能帮助到您的任何问题；

基本流程

服务收费参考

客户须知

1、待检测样品最好新鲜收集，如需累计样品可将样品放入-80保存以供DNA提取，或加入Trizol后-20保存以供RNA提取；

2、收集好的样品应尽快送至实验室进行核酸提取；

3、预实验开始前需提供待测基因序列或NCBI序列号以供引物设计和探针设计，客户也可直接提供引物和探针序列进行合成。

4、对于多种处理的样品最好能够提供阳性和阴性对照样品；

5、我们可以免费提供人，灵长类，大小鼠的内参基因检测，通常默认的内参基因为beta-actin，beta-tubulin，gapdh。如果需要检测其它特殊的内参基因请提前告知；

6、双方签订合同后，收取预付后进行试验；

7、如需参考国内外文献进行实验请提供相关文献依据；

8、血液，体液和粪便样品需保证不含有传染性病原体，如有特殊需求请提前告知，如未提前告知而造成人员危害的需追究法律责任；

公司提供

1、预实验和正式实验结果（包括Ct值，拷贝数等）；

2、绝对定量的标准品质粒和菌株；

3、剩余引物和探针及其序列信息；

4、实验报告