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甲醛变性电泳
甲醛变性电泳
实验原理
提取样品的总RNA后，一般根据RNA的凝胶电泳图来判断RNA的质量。由于RNA容易形成二级结构，因此常用甲醛变性胶来进行RNA电泳，得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况。将RNA通过凝胶电泳使之在凝胶中分离出来，通过加入标准核酸分子（markers）对其进行鉴定，并用于转膜、杂交等。
实验试剂
1. DEPC 水的处理：用量筒量取去离子水2L，在通风橱中，加入2ml DEPC到2L去离子水中，终浓度为0.1%的DEPC。迅速盖上盖子，混匀，然后放在摇床中中速摇荡至少4hr，再高压灭菌。灭菌时将瓶盖松开，15磅灭菌20min。
2. 10×MOPS缓冲液（即10×FA缓冲液）： 500ml
0.2mol/L MOPS（3-〔N-吗啉〕丙磺酸）
80mmol/L NaAc
10mmol/L EDTANa2
先用400 ml DEPC水溶解20.6g MOPS和4.1gNaAc后，加入10ml 0.5mol/L EDTA，定容500ml。用0.22mm滤器过滤除菌，装入棕色瓶中，室温避光保存。
或0.2mol/L MOPS（3-〔N-吗啉〕丙磺酸）
50mmol/L NaAc
10mmol/L EDTA
用2mol/L氢氧化钠调节pH至7.0，临用时用DEPC水稀释。
3. 1×MOPS电泳缓冲液（即1×甲醛变性胶电泳缓冲液1×running buffer）：1500ml
10×MOPS 150ml
37%甲醛 80ml
加水至1500ml，一般在3次电泳结束后需更换此电泳缓冲液。
4. 5 × 甲醛变性胶加样缓冲液（5×loading buffer）： 10ml
预先配制水饱和的溴酚蓝溶液：在1.5ml 离心管中加入约0.1mg溴酚蓝，加入1ml DEPC水溶解，充分振荡溶解，离心，可见离心管底部有溴酚蓝粉末剩余，上层液体即水饱和的溴酚蓝液。在15ml灭菌离心管中，依次加入以下各种成分：
4.0ml 10 × FA buffer
3.1ml 甲酰胺
2.0ml 100%的甘油
720ul 37%的甲醛
80ul 0.5MEDTA （PH 8.0）
16ul 水饱和的溴酚蓝
100ul DEPC水
混匀，分装，-20℃保存，常用放4℃保存。
或 甲醛凝胶变性RNA电泳加样缓冲液（10×）： 10
50％甘油
1mmol/L EDTA
0.25％溴酚蓝
0.25％二甲苯氰
5ml甘油、20ul 0.5mol/L EDTA、25mg溴酚蓝、25mg二甲苯氰，加DEPC水至10ml，高压后，4°C保存。
实验设备
1. 电泳设备
2. 紫外灯
实验步骤
1．电泳槽用0.3%H2O2浸泡30min，DEPC水冲洗晾干。
2．铺胶（40ml）
琼脂糖 0.55g
DEPC水 36ml
10×MOPS 5ml
37%甲醛 9ml
称0.55克琼脂糖加36ml DEPC水，微波炉加热溶解琼脂糖，肉眼观察无颗粒状悬浮物。冷却至50-60℃，加9ml 甲醛（37%）和5ml 10×电泳缓冲液，然后灌制凝胶，插入合适长度和宽度的梳子，于室温放置30分钟以上使凝胶凝固。
3．RNA样品处理（以一条泳道为例）一般取0.3 g的总RNA，加入1/5体积的5×加样缓冲液，65℃加热5 min，冰上骤冷，以消除RNA的二级结构。建议上样前在RNA样品中加入0.5-1.0 ul的溴化乙锭（EB，浓度1.0 mg/mL），而不在胶中加EB，这样电泳后的背景较低。配好的甲醛变性胶先在1×甲醛变性胶电泳缓冲液中预电泳15min。RNA样品在5-10 V/cm的电压降下电泳30min。
4．加2.0ml甲醛凝胶加样缓冲液（10×）
5．加样和电泳
将凝胶预电泳15min，电压降为5-10 v/cm。随后加样品和标准物，以3-4v/cm电压降电泳，电泳液为1×MOPS电泳缓冲液。直至溴酚蓝迁移至胶下游的3/4处。
6．电泳结束后，在紫外灯下，仔细测量28S rRNA和18S rRNA至加样孔的距离，并同荧光尺一起拍照，以记录标准物的位置。
注意事项
1．每一泳道至多可分析30mg RNA，通常用10-20mg总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1%以上）；如待测RNA含量极微，每个泳道加0.5-3.0mg poly(A) RNA。
2． 标准物28S rRNA≥6333 base；18S rRNA≥2366 base；9S兔b珠蛋白mRNA≥710 base。溴酚蓝在前(≥300bp)，二甲苯氰FF在后(≥4kb)。
