石蜡切片免疫组化实验步骤及常见问题

石蜡切片免疫组化实验

免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、酶、金属离子、同位素） 显色来确定组织细胞内抗原 （多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。

根据标记物的不同分为：免疫酶法、免疫荧光法、亲和组织化学法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。其中前三种最常用。今天主要介绍免疫酶法。

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免疫酶法实验原理

根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔 IgG 分子结合在多聚酶上形成多聚物分子， 其与待检的抗原特异性的结合后，加入底物显色。

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实验步骤

1. 石蜡切片置于 67 ℃ 烘箱中，烘片 2 小时，脱蜡至水，用 pH7.4 的 PBS 冲洗三次，每次 3 分钟（3×3'）。

2. 取一定量 pH=6.0 柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理 10 分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用 PBS 冲洗 2×3'。（注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定）

3. 每张切片加 1 滴 3% H2O2，室温下孵育 10 分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS 冲洗 3×3'。

4. 除去 PBS 液，每张切片加 1 滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育 2 小时。

5. PBS 冲洗 3×5'。除去 PBS 液，每张切片加 1 滴聚合物增强剂，室温下孵育 20 分钟。PBS 冲洗 3×3'。

6. 除去 PBS 液，每张切片加 1 滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育 30 分钟。PBS 冲洗 3×5'。

7. 除去 PBS 液，每张切片加 1 滴新鲜配制的 DAB 液（二氨基联苯胺），显微镜下观察 5 分钟。

8. 苏木素复染，0.1% HCl 分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。

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实验特点

1. 在切片加上一抗后，第二抗体标记多聚螯合物酶（HRP）的复合物与一抗结合，在多聚螯合物上有大量的 HRP 分子，使抗原信号有显着的放大，其敏感性较 SABC、SP 法高。

2. 由于多聚物在体内不存在，又不使用生物素，从而避免了由于生物素引起的非特异性背景染色，背景比 SABC、SP 法清晰。

3. 辣根过氧化物酶与二抗结合在多聚物上，替代传统方法的 二抗、三抗，减少了实验步骤，且试剂孵育时间短，只需 15 分钟，使得免疫组化方法更简单，实验时间比 SABC、SP 法大为缩短。