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大鼠I型胶原α1(COL-1α1) ELISA试剂盒操作概要

发布时间:2015-11-10

大鼠I型胶原α1(COL-1α1) ELISA试剂盒操作概要

特别说明: 

*: [96T/48T](打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整) 

#: 一周内使用可存于4℃,需长时间存放或多次使用建议存于-20℃. 

相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些,请在使用时量取而非直接倒出! 

检测原理: 

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗大鼠COL1α1抗体包被于酶标板上,实验时样品或标准

品中的大鼠COL1α1会与包被抗体结合,游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗大鼠COL1α1

抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗大鼠COL1α1抗体与结合在包被抗体上的大鼠COL1α1

结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物,游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB),

TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色,加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测

OD值,COL1α1浓度与OD450值之间呈正比,通过绘制标准曲线计算出样品中COL1α1的浓度。 

样品收集: 

1. 血清:全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟,取上清即可检测,收集

血液的试管应为一次性的无热原,无内毒素试管。 

2. 血浆:抗凝剂推荐使用EDTA-Na2,样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟,取上清即可

检测。避免使用溶血,高血脂样品。 

3. 组织匀浆:用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会

影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体

积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。

推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组

织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟,

取上清检测。 

4. 细胞培养上清:取细胞培养上清于1000×g离心20分钟,除去杂质及细胞碎片。取上清检测。 

5. 其它生物样品:1000×g离心20分钟,取上清即可检测 

大鼠I型胶原α1(COL-1α1) ELISA试剂盒操作概要

6. 样品应清澈透明,悬浮物应离心去除。 

7. 样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃,若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻

存于-20℃(1个月内检测),或-80℃(6个月内检测),避免反复冻融。 

8. 如果您的样品中检测物浓度高于标准品最高值,请根据实际情况,做适当倍数稀释(建议先

做预实验,以确定稀释倍数)。 

 

试验所需自备物品: 

1. 酶标仪(450nm波长滤光片) 

2. 高精度移液器,EP管及一次性吸头:0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 

3. 37℃恒温箱,双蒸水或去离子水 

4. 吸水纸 

 

检测前准备工作: 

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温。 

2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结

晶,属于正常现象,可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液(加热温度不要超

过50℃,使用时洗涤液应为室温)。当日使用。 

3. 标准品: 于10000×g离心1分钟,加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中,旋紧管盖,

静置10分钟,上下颠倒数次,待其充分溶解后,用移液器将其轻轻混匀(浓度为20ng/mL)。

然后根据需要进行倍比稀释(注:不要直接在反应孔中进行倍比稀释)。建议配制成以下浓

度:20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0ng/mL,标准品&样品稀释液直接作为空白孔

0ng/mL。如配制10ng/mL标准品:取0.5mL20ng/mL的上述标准品加入含有0.5mL标准品&样

品稀释液的EP管中,混匀即可,其余浓度依此类推。  

4. 生物素化抗体工作液:实验前计算当次实验所需用量(以100μL/孔计),实际配制时应多配

制100-200μL。使用前15分钟,以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)成工作

浓度。当日使用。 

5. 酶结合物工作液:实验前计算当次实验所需用量(以100μL/孔计),实际配制时应多配制

100-200μL。使用前15分钟,以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成工作浓度。

当日使用。 

标准品稀释方法图例:(以500μL/管为例,也可根据实际用量来稀释,如200μL/管) 

 

 1 2 3 4 5 6 7 8 Tube 

 20 10 5 2.5 1.25 0.625 0.313 0 ng/mL 

 

洗涤方法: 

1. 自动洗板机:每孔加入洗涤液350μL,注入与吸出间隔60秒。 

2. 手工洗板:甩尽孔内液体,在洁净的吸水纸上拍干,每孔加洗涤液350μL,浸泡1-2分钟,吸

去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体,在厚的吸水纸上拍干。 

 大鼠I型胶原α1(COL-1α1) ELISA试剂盒操作概要

操作步骤: 

实验开始前,各试剂均应平衡至室温;试剂或样品配制时,均需充分混匀,并尽量避免起泡。 

1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液 100μL,余孔分

别加标准品或待测样品 100μL,注意不要有气泡,加样时将样品加于酶标板底部,尽量不触

及孔壁,轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜,37℃孵育 90 分钟。为保证实验结果有效性,每次

实验请使用新的标准品溶液。 

2. 弃去液体,甩干,不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液 100μL(在使用前 15 分钟

内配制),酶标板加上覆膜,37℃温育 1 小时。 

3. 弃去孔内液体,甩干,洗板 3 次,每次浸泡 1-2 分钟,大约 350μL/每孔,甩干并在吸水纸

上轻拍将孔内液体拍干。 

4. 每孔加酶结合物工作液(临用前 15 分钟内配制)100μL,加上覆膜,37℃温育 30 分钟。 

5. 弃去孔内液体,甩干,洗板 5 次,方法同步骤 3。 

6. 每孔加底物溶液(TMB)90μL,酶标板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分钟左右(根据实际显色情 

况酌情缩短或延长,但不可超过 30 分钟。当标准孔出现明显梯度时,即可终止)。 

7. 每孔加终止液 50μL,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液

的加入顺序相同。 

8. 立即用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的光密度(OD 值)。应提前打开酶标仪电源,预热仪

器,设置好检测程序。 

9. 实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。 

大鼠I型胶原α1(COL-1α1) ELISA试剂盒操作概要 

注意事项: 

1. 保存:试剂盒中各试剂请按说明书提示合理存放。在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强

光中。所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染,否则可能会出现错误的结果。 

2. 酶标板:刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成

任何影响。暂时不用的板条应拆卸后放入备用铝箔袋,按推荐温度存放! 

3. 加样:加样或加试剂时,第一个孔与最后一个孔的加样时间间隔如果太大,将会导致不同的

“预温育”时间,从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。每次的加样时间最好控制在

10分钟内。推荐设置复孔。 

4. 温育:为防止样品蒸发,实验时必须给酶标板覆膜;洗板后应尽快进行下步操作,避免酶标

板处于干燥状态;严格遵守给定的温育时间和温度。 

5. 洗涤:洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸上拍干,勿将滤纸直接放入反应孔中吸

水。在读数前要注意清除底部残留的液体和手指印,以免影响酶标仪读数。 

6. 试剂配制:Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate体积较

小,运输过程会使液体沾到管壁或瓶盖,因此使用前1000转/分离心1min,以使附着管壁或瓶

盖的液体沉积到管底。取用前,请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。标准品、生物素化抗

体工作液、酶结合物工作液请根据所需用量配制,并使用相应的稀释液配制,不能混淆。请

精确配制标准品及工作液,尽量不要微量配制(如吸取Concentrated Biotinylated Detection 

Ab时,一次不要小于10μL),以避免由于不准确稀释而造成浓度误差;请勿重复使用已稀释

过的标准品、生物素化抗体工作液、酶结合物工作液。若需要分次使用标准品应按照每一次

用量分装,将其放在-20~-80℃贮存。避免反复冻融。 

7. 显色时间的控制:加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如每隔5分钟),如梯度已很

明显,请提前加入终止液终止反应,避免颜色过深影响酶标仪读数。 

8. 底物:底物请避光保存,在储存和温育时避免强光直接照射。 

9. 混匀:充分轻微混匀对反应结果尤为重要,最好使用微量振荡器(使用最低频率),如无微量

振荡器,可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。 

10. 安全:试验中请穿着实验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液样品

时,请按国家生物试验室安全防护条例执行。 

11. 不同批号的试剂盒组份不能混用(洗涤液和反应终止液除外) 

12. 试验中所用的EP管和吸头均为一次性使用,严禁混用,否则将影响试验结果! 

结果判断: 

1. 每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图,如设置复孔,则应取其平均值计算。以标准

品的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标,标准品的浓度

为纵坐标,绘出标准曲线。 

2. 推荐使用专业的曲线制作软件,如curve expert 1.3或1.4,在软件界面既可根据样品OD值,

由标准曲线查出相应的浓度,乘以稀释倍数;亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程

式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。 

3. 若样品OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测,计算浓度时应乘以稀释倍数。 

大鼠I型胶原α1(COL-1α1) ELISA试剂盒操作概要 

灵敏度、检测范围、特异性和重复性: 

●灵敏度:最小可测 0.188ng/mL。 

●检测范围:0.313–20ng/mL。 

● 特异性:可检测重组或天然的大鼠 COL1α1,且与其它相关蛋白无交叉反应。 

● 重复性:板内,板间变异系数均<10%。 

 

操作概要 

1. 在各孔中加入标准品或样品各 100μL, 37℃孵育 90 分钟 

2. 倒去孔内液体,加入 100μL 生物素化抗体工作液,37℃孵育 60 分钟 

3. 洗涤 3 次 

4. 加入 100μL 酶结合物工作液, 37℃孵育 30 分钟 

5. 洗涤 5 次 

6. 加入 90μL 底物溶液, 37℃孵育 15 分钟左右 

7. 加入 50μL 终止液,立即在 450nm 波长处测量 OD 值 

8. 结果计算 


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