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PGE1 (Prostaglandin E1) ELISA Kit

发布时间:2015-10-20

PGE1 (Prostaglandin E1) ELISA Kit

前列腺素E1(PGE1)酶联免疫吸附测定试剂盒

检测原理: 

本试剂盒采用竞争ELISA法。用PGE1抗原包被于酶标板上,实验时样品或标准品中的PGE1与包被的PGE1竞争生物素标记的抗PGE1单抗上的结合位点,游离的成分被洗去。加入辣根过氧化物酶标记的亲和素,生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物,游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB),TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色,加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值,PGE1浓度与OD450值之间呈反比,通过绘制标准曲线计算出样品中PGE1的浓度。 

样品收集: 

1. 血清:全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟,取上清即可检测,收集血液的试管应为一次性的无热原,无内毒素试管。 

2. 血浆:抗凝剂推荐使用EDTA-Na2,样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟,取上清即可检测。避免使用溶血,高血脂样品。 

3. 组织匀浆:用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。

推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟,取上清检测。 

4. 细胞培养上清:取细胞培养上清于1000×g离心20分钟,除去杂质及细胞碎片。取上清检测。 

5. 其它生物样品:1000×g离心20分钟,取上清即可检测 

具体处理方法可参考:

6. 样品应清澈透明,悬浮物应离心去除。 

7. 样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃,若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻存于-20℃(1个月内检测),或-80℃(6个月内检测),避免反复冻融。 

8. 如果您的样品中检测物浓度高于标准品最高值,请根据实际情况,做适当倍数稀释(建议先做预实验,以确定稀释倍数)。 

 

试验所需自备物品: 

1. 酶标仪(450nm波长滤光片) 

2. 高精度移液器,EP管及一次性吸头:0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 

3. 37℃恒温箱,双蒸水或去离子水 

4. 吸水纸 

 

检测前准备工作: 

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温。 

2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象,可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液(加热温度不要超过50℃,使用时洗涤液应为室温)。当日使用 

3. 标准品: 于10000×g离心1分钟,加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中,旋紧管盖,静置10分钟,上下颠倒数次,待其充分溶解后,用移液器将其轻轻混匀(浓度为5000pg/mL)。

然后根据需要进行倍比稀释(注:不要直接在反应孔中进行倍比稀释)。建议配制成以下浓度:5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、0pg/mL,标准品&样品稀释液直接作为空白孔0pg/mL。如配制2500pg/mL标准品:取0.5mL5000pg/mL的上述标准品加入含有0.5mL标准品&样品稀释液的EP管中,混匀即可,其余浓度依此类推。 

4. 生物素化抗体工作液:实验前计算当次实验所需用量(以50μL/孔计),实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟,以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)成工作浓度。当日使用。 

5. 酶结合物工作液:实验前计算当次实验所需用量(以100μL/孔计),实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟,以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成工作浓度。

当日使用。 

标准品稀释方法图例:(以500μL/管为例,也可根据实际用量来稀释,如200μL/管) 




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